В это время византийцы готовились к собору, который должен был решить вопрос об унии с Римской Церковью. Русская митрополия была самой крупной митрополией Константинопольской Церкви и Византии для заключения унии была необходима ее лояльность. Поэтому, чтобы обезопасить себя от неожиданностей, греки постарались максимально отстранить русских от участия в этой антиправославной затее.
Митрополит Исидор, едва приехав в Москву, стал собираться в Италию на предстоящий собор. Он сумел убедить московского князя в необходимости соединение с Римом без ущерба православию. «Если уж ты непременно желаешь идти на собор, — напутствовал митрополита великий князь, — то принеси нам оттуда наше древнее Православие, а нового и чужого мы не примем». Исидор выехал в Италию с огромной свитой в 100 человек. Гигантский обоз в 200 коней вез подарки участникам собора от великого московского князя. Слух о том, что митрополит едет во «Фряжскую землю» обращать «латину» в Православие распространился по всей Руси. По пути следования митрополита простой люд встречал его с ликованием.
Однако на Флорентийском соборе в Италии Исидор оказался в числе наиболее активных сторонников Римской Церкви. Его роль в деле заключения унии была столь велика, что Римский папа наградил его титулом кардинала и подчинил его власти не только Русь, но и Ливонию с Польшей. Епископа Авраамия Суздальского, который входил в делегацию Исидора, голодом и тюремным заточением принудили к подписанию унии. После подписания акта Авраамий бежал домой в Россию, заручившись поддержкой и благословением святителя Марка Ефесского. В Москве он принес покаяние и рассказал об увиденном на соборе: «Греки, давшие Руси православную веру, во главе с патриархом и императором оказались отступниками от православия».
В марте 1441 года митрополит-кардинал Исидор прибыл в Москву. Здесь его ждали с иным настроением, чем во время его отъезда на собор. После провозглашения Исидором акта об унии с Римом, великий князь велел заключить отступника в Чудов монастырь до соборного разбирательства. Ему предлагали покаяться и вернуться в лоно Православия. Но Исидор наотрез отказался, а через некоторое время сбежал со своим учеником в Рим. Русская Церковь оказалась в трудном положении. С одной стороны ей необходимо было защитить Православие, с другой — не нарушить каноны и церковные установления. Разрыв с униатским Константинополем был неизбежен. Русской митрополии была необходима самостоятельность, к которой она до сих пор не стремилась. Однако исторические обстоятельства принуждали нашу Церковь перейти к самостоятельному управлению ради блага Православия.
Не сразу, спустя еще шесть лет после побега Исидора, великий князь и собор русских епископов приняли решение об избрании митрополита в Москве из числа русских архиереев. Церковный собор, как и 17 лет тому назад, вновь избрал на митрополичью кафедру рязанского епископа Иону, а 5 декабря 1448 года состоялось торжественное поставление Ионы в русские митрополиты. Это событие стало началом автокефалии, то есть самостоятельности Русской Православной Церкви.
Избранный митрополит Иона был уроженцем Костромской земли. Уже в молодости Иона стал монахом и, желая подражать подвигам преподобного Сергия, пришел в Московские земли в Симонов монастырь к ученику преподобного. Природная одаренность сочеталась в нем с духовной глубиной монаха-подвижника, каковым он оставался всю свою жизнь. Святитель Иона после своего избрания направил окружное послание во все русские епархии. В нем он объяснял, что причиной нарушения церковного порядка явилось отступничество греков от Православия на Флорентийском соборе.
Узнав о смерти Византийского императора Иоанна, главного сторонника и творца унии, на Руси была предпринята попытка возвратиться к прежнему порядку. Великий князь направил послание преемнику императора Иоанна, в котором оправдывал самостоятельное поставление Ионы на митрополию после предательства и побега Исидора. Однако вновь исторические обстоятельства помешали возвращению Русской Церкви в лоно Константинополя. 29 мая 1453 года Константинополь пал под ударами турок. Византийская империя прекратила свое существование и Константинопольская Церковь попала под власть турок. Таким образом, сначала Флорентийская уния, а затем зависимость патриарха Константинопольского от турецкого султана мешала вернуть былое доверие к грекам. Русь была на тот момент единственной православной державой в мире. Она переживала огромный духовный подъем. Эти обстоятельства повлияли на дальнейшее осмысление независимости Русской Церкви и идеи преемственности Московской Руси по отношению к наследию Рима, Византии, Православного Царства.